Introducción
El bovino Curraleiro Pé Duro es una raza criolla brasilera, originaria del Bos taurus ibericus, traído por los colonizadores europeos en el siglo XVI, y sometido a constante selección natural y adaptación por más de 400 años. Este taurino tropical representa un tesoro genético, ya que a pesar de no tener niveles superiores de producción, es rústico, resistente al calor, enfermedades y parásitos, y además aprovecha eficientemente pastos de baja calidad. Debido a la importación de razas especializadas con mayor desempeño zootécnico, el Curraleiro Pé Duro fue descartado de los rebaños, lo que casi provocó su desaparecimiento (Mariante et al., Reference Mariante, Albuquerque, Egito, McManus, Lopes and Paiva2009). Gracias a programas de conservación aún existen ejemplares, en el Centro Oeste y Noreste brasilero, registrando 3.692 animales en el año 2008, distribuidos entre los estados de Pará, Piauí, Tocantins y Goiás (Fioravanti et al., Reference Fioravanti, Juliano, Costa, Abud, Cardoso, Carpio and Costa2011). La conservación consta de dos estrategias: una es la in situ, donde los animales permanecen en ambientes naturales o artificiales, y otra la ex situ, criopreservando en bancos de germoplasma los espermatozoides, ovocitos, embriones y otras células, como fuente de multiplicación, regeneración y distribución de una población animal en extinción (Mariante y Egito, Reference Mariante and Egito2002). Según Dode y Rumpf (Reference Dode and Rumpf2002) técnicas de reproducción asistida son utilizadas en conservación animal, destacando la inseminación artificial (IA), transferencia de embriones (TE), producción in vitro de embriones (PIV) e inyección intra-citoplasmática de espermatozoides (ICSI). Desde 1983, Embrapa Recursos Genéticos y Biotecnología (CENARGEN) realiza la conservación ex situ de razas criollas brasileras, criopreservando diferentes células en el Banco Brasileiro de Germoplasma Animal (BBGA) (Mariante y Egito, Reference Mariante and Egito2002). Para asegurar el futuro del bovino Curraleiro Pé Duro (Figura 1) se necesitan más estudios enfocando parámetros reproductivos, por lo que objetivamos evaluar la calidad del semen criopreservado de 21 toros de esta raza, perteneciente al BBGA.
Toro Curraleiro Pé Duro en el bioma Cerrado.
Material y métodos
Esta investigación fue realizada en el año 2011, en las instalaciones del laboratorio de reproducción animal CENARGEN (DF). Se utilizaron pajillas de semen de 21 toros Curraleiro Pé Duro, donadas por el BBGA en número de dos unidades por reproductor, excepto cinco toros, con diez dosis cada uno. Este material genético se criopreservó entre 1994 y 2008, mediante protocolos convencionales desarrollados por el CENARGEN. Las dosis fueron descongeladas por 30 segundos en baño María (37°C), y el semen depositado en un tubo para evaluación in vitro.
Evaluación de morfología espermática
La morfología espermática fue evaluada de acuerdo con Barth y Oko (Reference Barth and Oko1989), utilizando microscopio de contraste de fase (Nikon Eclipse E200) con inmersión y aumento de 1000x. Se contaron 200 espermatozoides por muestra, clasificándolos en normales y con defectos (cabeza o cola), siendo expresado en porcentajes.
Evaluación de cinética espermática
La cinética espermática fue evaluada por el Computer Assisted Sperm Analysis (CASA), modelo IVOS Ultimate 12 de la Hamilton Thorne Biosciences, ajustado (set up) para semen bovino. Se colocó 10 µL de semen en la cámara de Makler, con selección de tres campos de lectura, evaluando: motilidad total (MT, %) y progresiva (MP, %); velocidad de trayecto (VAP, μm/s), rectilínea (VSL, μm/s) y curvilínea (VCL, μm/s); amplitud lateral de cabeza (ALH, μm); frecuencia de batimientos de cola (BCF, Hz); rectilinearidad (STR, %); linearidad (LIN, %) y células rápidas (RPD, %).
Evaluación de integridad de la membrana plasmática y acrosoma
La integridad de membrana plasmática fue evaluada utilizando diacetato de 6 carboxifluoresceína (C-FDA) y yoduro de propidio (PI) (Harrison y Vickers, Reference Harrison and Vickers1990). Una muestra de semen (10 µL) fue diluida en solución colorante (40 µL), compuesta por 480 µL de citrato de sodio a 3%; 5 µL de formol salina a 1,6%; 5 µL de IP 0,75 mM; y 10 µL de C-FDA 0,46 mg/mL en DMSO. Los espermatozoides teñidos de rojo se consideraron con membrana plasmática dañada y los de verde con membrana íntegra. Para evaluar la integridad acrosomal se utilizó la conjugación isotiocianato de fluoresceína (FITC) con lectina Peanut aglutinin (PNA) y PI (Klinc y Rath, Reference Klinc and Rath2007). Una muestra de semen (10 µL) fue diluida en solución colorante (30 mL), con los mismos componentes usados en la evaluación de membrana plasmática, excepto C-FDA que fue substituido por 10 µL de FITC-PNA (1 mg/mL en PBS). Las células teñidas de rojo se contabilizaron como muertas. En los espermatozoides vivos el acrosoma teñido de verde fue considerado como reaccionado, y el acrosoma sin fluorescencia, íntegro. Ambas evaluaciones se realizaron en microscopio de epifluorescencia (Axiophot Zeiss: filtro de longitud de onda 395/420 nm y 494/517 nm excitación/emisión). Aproximadamente 200 células fueron examinadas en cada muestra y los resultados se expresaron en porcentajes.
Evaluación de tasas de fecundación
Para evaluar las tasas de fecundación fueron utilizadas dosis de sólo cuatro toros Curraleiro Pé Duro, debido a la escasez de pajillas disponibles. Se utilizó la metodología propuesta por Carvalho et al. (Reference Carvalho, Sartori, Machado, Mourão and Dode2010), con tres replicas independientes, donde a 18 horas post inseminación in vitro los posibles cigotos fueron retirados de las gotas de fecundación y transferidos para una gota de 200 µL de tampón fosfato (PBS). Estos fueron desnudados y fijados en solución de etanol y ácido acético glacial (3:1), por 24 horas. Después se lavaron y tiñieron con solución lacmoide a 1% en ácido acético glacial 45%. La lectura de las láminas fue en microscopio de contraste de fase bajo inmersión, con aumento de 1000x (Nikon Eclipse E200). Se utilizó 336 ovocitos, siendo clasificados en no fecundados (presencia de cromatina femenina y ausencia de masculina) y fecundados (presencia de cromatina femenina y espermatozoide en el citoplasma, presencia de cabeza descondensada, pronúcleo, clivaje y polispermia).
Análisis estadístico
Los datos obtenidos en los exámenes espermáticos de las 21 dosis fueron analizados a través del programa R (R Development Core Team, 2011). Primero se realizó estadística descriptiva (promedio y desvío estándar). Después se escogieron parámetros para la construcción de un dendrograma, mediante el método UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Means), utilizando la distancia Euclidiana padronizada. El Cluster formó tres grupos, los cuales fueron comparados en cada examen espermático a través de análisis de varianza y test Duncan, a nivel de significancia del 5%. Las tasas de fecundación y estados de cromatina 18 horas post FIV se compararon por el test Chi-cuadrado.
Resultados y discusión
Evaluación de la calidad espermática
Morfología espermática
Considerando 70% como mínimo de espermatozoides normales para semen descongelado bovino (CBRA, 1998), las 21 dosis Curraleiro Pé Duro presentaron buen promedio (81,1% ± 13,3%). Individualmente tres dosis fueron inferiores: DT1 (60,2%); DT10 (37,5%) y DT17 (68,2%). Los defectos mayores (DMA) en una muestra seminal no deben superar el 20% (CBRA, 1998), a pesar de haber encontrado cinco dosis con alto porcentaje (DT1, 34,7%; DT7, 24,3%; DT10, 39,5%; DT16, 22,5% y DT17, 28,1%), el promedio general de DMA era 14,7% ± 9,9% y los defectos menores 4,2% ± 7,2%. Este promedio fue mejor al encontrado por Sousa et al. (Reference Sousa, Freneau, Fioravanti and Juliano2004) en ocho toros Curraleiro Pé Duro (21,1% ± 8,4%). Ciertos DMA superaron el límite de 5% que relata Freneau (Reference Freneau2011) para anormalidades individuales: cráter (DT1, 21,8%; DT16, 9,0%); contorno anormal (DT1, 5,6%); gota proximal (DT10, 19,0%); cola fuertemente doblada (DT11, 7,2%); cola fuertemente doblada con gota (DT7, 7,1%; DT17, 15,1%; DT10, 6,5%) y cabeza piriforme (DT20, 6,5%). Britto y Mello (Reference Britto and Mello1988) obtuvieron individualmente DMA exacerbados, en el semen de cinco toros Curraleiro Pé Duro, destacando pouch formation (17,1%). Las alteraciones encontradas pueden tener origen en deficiencias nutricionales, interferencia climática y escasa selección de este grupo genético nativo. Además las altas tasas de gota proximal y cola fuertemente doblada con gota indicarían problemas de madurez sexual, epidídimo y fertilidad (Rao, Bane y Gustafsson, Reference Rao, Bane and Gustafsson1980). Saacke (Reference Saacke2008) caracteriza cabeza piriforme, cráter y pouch formation como defectos no compensables, ya que suelen poseer aberraciones en la cromatina que afectan la fecundación y/o desarrollo embrionario, causando sub-fertilidad espermática.
Cinética espermática
Según Kathiravan et al. (Reference Kathiravan, Kalatharan, Karthikeya, Rengarajan and Kadirvel2011), altos porcentajes de MP y RPD revelan resistencia a criopreservación. Además la MP está correlacionada con MT, y contribuye 62,6% en variaciones de las tasas de fecundación, teniendo como promedio grupal 27,3% ± 9,7% y RPD 35,4% ± 11,4%. En el promedio individual destacaron las dosis DT5 (MP 45%, RPD 55%), DT9 (MP 40%, RPD 48%), DT16 (MP 39%, RPD 47%) y DT19 (MP 31%, RPD 51%); contrario a DT10 (MP 15%, RPD 17%), DT18 (MP 9%, RPD 11%) y DT20 (MP 13%, RPD 17%) que fueron inferiores. Las velocidades VAP, VSL y VCL (μm/s) fueron altas en DT5 (105,6; 88,4; 179,2), DT11 (88,7; 72,1; 156,9), DT19 (87,2; 60,9; 168,4) y DT21 (91,3; 75,0; 156,5). Para ALH (μm) obtuvieron tasas superiores DT8 (7,3), DT14 (7,6) y DT19 (7,7), lo que concuerda con sus bajos valores en BCF (DT8, 20,4 Hz; DT14, 22,4 Hz; DT19, 23,6 Hz), STR y LIN (DT8, 67,0%, 39,0%; DT14, 75,0%, 41,0%; DT19, 70,0%, 38,0%). La DT19 mostró hiperactividad espermática (HE), por sus altos valores de velocidad; ALH superior en el grupo, así como BCF, STR y LIN inferiores. La HE conduce a movimientos vigorosos y desordenados, provocando trayectoria irregulary y curva, situación que sólo ocurre in vivo en el local de fecundación (Mortimer, Reference Mortimer1997; Verstegen, Iguer-Ouada y Onclin, Reference Verstegen, Iguer-Ouada and Onclin2002); mas in vitro podría favorecer en la penetración del ovocito. La criopreservación origina mudanzas en membrana plasmática, similares a las de capacitación. Esa “criocapacitación” post descongelamiento talvez sería responsable por la HE detectada (Januskauskas et al., Reference Januskauskas, Gil, Soderquist, Haard, Haard, Johannisson and Rodriguez-Martinez1999).
Integridad de membrana plasmática y acrosoma
Se consideraron la membrana plasmática íntegra (MPI) y los espermatozoides vivos con acrosoma íntegro (EVAI), porque reflejan buena conformación estructural y funcional de la célula (Garner et al., Reference Garner, Pinkel, Johnson and Pace1986; Graham, Reference Graham2001). En el promedio general MPI obtuvo 36,7% ± 14,2% y EVAI 34,0% ± 14,4%. Los valores más bajos fueron: MPI (DT10, 15,0%; DT14, 21,3% y DT18, 10,5%) y EVAI (DT2, 18,0%; DT10, 12,5%; DT14, 21,5%; DT18, 9,5% y DT20, 22,0%). Para Januskauskas, Johannisson y Rodriguez-Martinez (Reference Januskauskas, Johannisson and Rodriguez-Martinez2003), la integridad de membrana plasmática es la variable con mayor impacto en la fertilidad, caso contrario a Carvalho et al. (Reference Carvalho, Sartori, Machado, Mourão and Dode2010) que no identificaron alta correlación con la fecundación. Cabe resaltar que la reacción acrosómica prematura disminuye el potencial reproductivo del espermatozoide (Silva y Gadella, Reference Silva and Gadella2006). Casi todas las dosis obtuvieron un porcentaje bajo (≤ 2,0%), para espermatozoides vivos con acrosoma reaccionado, excepto DT17 con 14,5%, que puede estar relacionado a su alta tasa de DMA (28,1%).
Parámetros escogidos para construcción de un dendrograma
Fueron analizados parámetros que según Amann (Reference Amann1989) son parte de los atributos espermáticos para fecundación (NRM, DMA, MP, RPD, MPI y EVAI). Se construyó un dendrograma (Figura 2) utilizando la distancia Euclidiana, para formar tres grupos (G1, G2 y G3). La DT19 y DT10 resultaron excluidas, por ser consideradas outliers, al presentar valores muy distantes en relación a las demás dosis (Sartorio, Reference Sartorio2008). Se sabe que la DT19 mostró HE y DT10 obtuvo los valores más bajos en los exámenes in vitro.
Dendrograma de las 21 dosis de semen.
Caracterización de los grupos y comparación estadística
En los tres grupos formados (Cuadro 1), el G1 alcanzó altos valores en morfología; la mejor cinética; así como viabilidad y tasas de espermatozoides vivos con acrosoma íntegro razonables, mostrando cierta superioridad en comparación al G2. El G2 obtuvo la mayor tasa de defectos morfológicos; no en tanto cinética, viabilidad y células vivas con acrosoma íntegro aceptables, características que son propias de espermatozoides con defectos no compensables (Saacke, Reference Saacke2008). G3 obtuvo altos porcentajes de morfología espermática como G1, pero la peor cinética, integridad de membrana plasmática y acrosoma, indicando mayor presencia de espermatozoides muertos, ya que según Garner et al. (Reference Garner, Pinkel, Johnson and Pace1986) células con membrana plasmática dañada no poseen movimiento.
Parámetros espermáticos analizados en los tres grupos formados por el dendrograma.
DS: desvío estándar. Promedios con letra diferente (a,b,c) no son iguales, por el Test Duncan al 5%.
Evaluación de las tasas de fecundación
Se utilizaron dosis de sólo cuatro toros Curraleiro Pé Duro (DT18, DT19, DT20 y DT21), debido al amplio estoque de pajillas donadas por el BBGA para esos reproductores. El semen presentó valores NRM y DMA, dentro de los padrones CBRA (1998). Sólo la DT18 y DT20 fueron inferiores en cinética y exámenes de fluorescencia. Previo al uso de las dosis para FIV, estas se seleccionaron mediante gradiente Percoll (45:90%), eliminando los espermatozoides con defectos. Después fue evaluada la MP en el microscopio de contraste de fase, tanto pre como post pasaje por el gradiente, siendo que incrementó considerablemente. Rodriguez-Martinez (Reference Rodriguez-Martinez2005) relata que esa prueba mide la capacidad de migración espermática, seleccionando las células con mayor potencial para ultrapasar in vitro la barrera del Percoll, que simularía el trayecto in vivo hasta el local de fecundación. Una vez tratadas las dosis seminales para FIV, se seleccionó e inseminó in vitro 336 ovocitos, evaluando post 18 horas las tasas de fecundación (Cuadro 2).
Tasas de fecundación ovocitaria 18 horas post inseminación in vitro.
NO: número de ovocitos; N: número; X2: Chi-cuadrado.
Las tasas de fecundación fueron altas y próximas, sin diferencia estadística significativa, revelando resultados no esperados antes del Percoll (45:90%). Como fue el caso de DT18 y DT20, que tenían bajos porcentajes para MP (33%; 30%), en el microscopio de contraste de fase, y exámenes de fluorescencia (MPI 10,5%; 28,3% y EVAI 9,5%; 22%), pero post Percoll mostraron buena MP (70%; 53%) y fecundación ovocitaria (74,4%; 68,8%). Según Tangue et al. (Reference Tangue, Van Soom, Sterckx, Maes and De Kruif2002), las tasas de fecundación obtenidas son aceptables (> 60%), revelando la capacidad espermática in vitro del semen Curraleiro Pé Duro, para ligar y penetrar la ZP del ovocito, así como promover la fertilización. Este resultado fue algo similar al obtenido por Obando, Luque y Martínez (Reference Obando, Luque and Martínez2003), en las tasas de FIV (≥ 61,9%) de cinco toros de la raza criolla San Martinero en el trópico colombiano.
Se constató en los cigotos, que los estados de cromatina masculina 18 horas post inseminación in vitro presentaron valores estadísticamente diferentes. Con tasas superiores para pronúcleo (> 60%), siendo que la DT19 obtuvo el mayor porcentual, quizás debido a su HE que contribuyó en la FIV, en cuanto la DT20 el menor, y además un valor elevado para cabeza descondensada. Según Eid, Lorton y Parrish (Reference Eid, Lorton and Parrish1994), esto revelaría en DT20 una fecundación tardía, posiblemente debido a sus porcentajes de cabeza piriforme (6,5%), defecto espermático no compensable, que podría haber ultrapasado el gradiente de Percoll, y afectaría una futura embriogénesis si fuese desarrollada. Finalmente, los resultados obtenidos sugieren que el G1 sea utilizado en la IA a campo, por tener valores favorables para fecundación in vivo. Diferente de la DT19, DT10, G2 y G3, que deben utilizarse con prioridad, para evitar mayor deterioro de estas dosis y en estricta asociación a biotecnologías reproductivas, como el pasaje por gradiente Percoll y PIV de embriones, que optimizarán los requisitos espermáticos para fecundación, como ya fue verificado, sabiendo que sólo espermatozoides competentes tienen contacto con el ovocito (Barbas y Mascarenhas, Reference Barbas and Mascarenhas2009). De esa forma se evitará la pérdida de la valiosa variabilidad genética de estas dosis de semen del BBGA, garantizando la máxima producción de becerros y embriones Curraleiro Pé Duro.
Conclusiones
La calidad seminal encontrada en las dosis del BBGA presentó variabilidad, mostrando características favorables y desfavorables para fecundación. Esto indica la importancia de la evaluación espermática para determinar el uso adecuado de las dosis seminales, tanto in vivo como in vitro, en asociación a biotecnologías reproductivas que busquen resultados positivos. Permite así la conservación del bovino Curraleiro Pé Duro, a través de programas de recuperación del efectivo poblacional y criopreservación en bancos de germoplasma, tal como viene siendo ejecutado por instituciones de investigación y criadores de esta raza. También surge su posible uso en el cruzamiento industrial con razas comerciales, para otorgar mayor rusticidad y adaptación al trópico brasilero.
